Η κυτταροτοξικότητα αναφέρεται στον ρυθμό των τοξικών επιδράσεων σε ένα ζωντανό κύτταρο. Πραγματοποιείται ένας αριθμός δοκιμών για την κατανόηση αυτού του λόγου. Στην πραγματικότητα, οι δοκιμές που αξιολογούνται με τη μέτρηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού και των τοξικών επιδράσεων στο κύτταρο ονομάζονται δοκιμές κυτταροτοξικότητας.
Αυτές οι δοκιμές συλλέγονται στο πλαίσιο του κύριου θέματος 3.
- Δοκιμές με άλατα τετραζολίου
- Δοκιμή απελευθέρωσης ενζύμου LDH
- Δημιουργούν δοκιμές κυτταροτοξικότητας που περιλαμβάνουν μεθόδους φωταύγειας.
Δοκιμές που διεξάγονται με τη βοήθεια αλάτων τετραζολίου: Τα άλατα τετραζολίου είναι ενώσεις που είναι ετεροκυκλικές οργανικές ενώσεις. Έχει συντεθεί και ταυτοποιηθεί με περισσότερα από τα μέλη του 1000 από τα χρόνια που ανακαλύφθηκε (Altman, 1976). Μαζί με τη μείωση των αλάτων τετραζολίου λαμβάνοντας ηλεκτρόνια, βοηθά επίσης να μετασχηματιστεί το φορμαζάνη σε μια δομή που ονομάζεται αλλαγή χρώματος. Οι αντιδράσεις χρώματος εντοπίζονται μόνο στα ζωντανά κύτταρα. Οι δοκιμές τετραζολίου δοκιμάζονται σε τρία στάδια. Στο πρώτο στάδιο, τα ζωντανά κύτταρα εκτίθενται σε μια συγκεκριμένη ποσότητα τοξικής ουσίας. Στο δεύτερο στάδιο, η τοξική ουσία απομακρύνεται η μία από την άλλη και προστίθεται ένωση τετραζολίου και επωάζεται για ώρες 1-4. Στα τελευταία στάδια, η αλλαγή χρώματος μετράται με φασματοφωτομετρική μέθοδο και γίνεται ο προσδιορισμός του αριθμού των ζωντανών ή νεκρών κυττάρων.
Δοκιμή απελευθέρωσης ενζύμου LDH: Άλλη μέθοδος που χρησιμοποιείται στην ανάλυση της κυτταρικής βιωσιμότητας είναι ο προσδιορισμός της δραστικότητας γαλακτικής δεϋδρογενάσης (LDH) που απελευθερώνεται από τα κατεστραμμένα ή νεκρά κύτταρα στο μέσο. (Decker και Lohmann-Matthes, 1988, Korzeniewski και Callewaert, 1983). Η γαλακτική αφυδρογονάση είναι γνωστή ως κυτταροπλασματικό ένζυμο που βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα. Όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε τοξικά αποτελέσματα, η ακεραιότητά τους στην μεμβράνη πλάσματος διακόπτεται και το ένζυμο LDH διαρρέει από τα κύτταρα και περνά στο μέσο. Συνεπώς, η εκτίμηση βλάβης διεξάγεται με μέτρηση της ενζυμικής δραστικότητας LDH μετά την έκθεση.
Μέθοδοι φωταύγειας:
Alamar Blue Fluorescence Test και άλλες μέθοδοι φθορισμού: Η μπλε δοκιμή Alamar χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τα άτομα Erb και Ehlers (1950) για τον προσδιορισμό της βακτηριακής μόλυνσης σε βιολογικά υγρά και γάλα και αργότερα στη μελέτη των Ahmed et al. (1950) προσάρμοσε αυτές τις δοκιμές ως πλευρική επιλογή στη δοκιμή ενσωμάτωσης ραδιενεργού [1994 Η] θυμιδίνης. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στη μετατροπή της ένωσης που ονομάζεται μπλε alamar (resazurin) στην ένωση resorufin μαζί με τα ζωντανά κύτταρα. Η ρεσαζουρίνη είναι γνωστή ως οξειδωτική κυανό χρωστική οξειδοαναγωγική ουσία, η οποία περνά ελεύθερα μέσω της κυτταρικής μεμβράνης για να εισέλθει στο κύτταρο, όπου ανάγεται και μετασχηματίζεται σε φθορίζουσα ροζ ένωση σύνθεσης ρεσορουφίνης. Τα νεκρά κύτταρα δεν μπορούν να μειώσουν την ρεζαζουρίνη και δεν είναι σε θέση να παράγουν σήμα φθορισμού λόγω απώλειας μεταβολικής δραστηριότητας. Το προκύπτον σήμα ανιχνεύεται με τη χρήση φθορομέτρων και η ένταση αυξάνεται καθώς αυξάνεται ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων.
Δοκιμή βιοφωταύγειας ATP: Οι μολονέτες τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) δρουν ως πηγές ενέργειας με βιολογικά συστήματα και μπορούν να βρεθούν σε όλα τα μεταβολικά ενεργά κύτταρα. (Crouch κ.ά., 1993). Μετά τον κυτταρικό θάνατο, η κατάσταση σύνθεσης ATP του κυττάρου εξαφανίζεται και οι ενδογενείς ΑΤΡάσες εκτελούν ταχεία αποικοδόμηση του άμεσα ΑΤΡ. Για το λόγο αυτό, το ενδοκυτταρικό περιεχόμενο ΑΤΡ έχει περιγραφεί ως ο κύριος δείκτης της κυτταρικής βιωσιμότητας και γίνεται μία από τις μεθόδους προσδιορισμού βιωσιμότητας. Η δοκιμή βιοφωταύγειας ATP έχει οριστεί ως η ταχύτερη, πιο ευαίσθητη και ευκολότερη μέθοδος μεταξύ των δοκιμών βιωσιμότητας που εκτελούνται σε πολλαπλάσια (Lomakina et αϊ., 2015, Riss κ.ά., 2006).
Δοκιμή βιοφωταύγειας σε πραγματικό χρόνο: Οι περισσότερες από τις δοκιμές βιωσιμότητας έχουν τη μορφή ενός τελικού σημείου των οποίων τα κύτταρα δεν έχουν καταστραφεί ή δεν επιτρέπεται να διερευνηθούν περαιτέρω, καθιστώντας αδύνατη την κινητική και την ανάλυση σε πραγματικό χρόνο των τοξικών ουσιών. Επειδή η τοξικότητα εξαρτάται από το χρόνο και τη δόση, οι επιδράσεις των διαφόρων φάσεων δόσεων μπορούν να γίνουν κατανοητές μόνο μελετώντας σε διαφορετικούς χρόνους. Παρόμοια με τη δοκιμασία βιοφωταύγειας ΑΤΡ, το ένζυμο λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε επίσης σε αυτή τη δοκιμασία. Εντούτοις, το ένζυμο λουσιφεράσης που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη δοκιμασία ελήφθη από έναν διαφορετικό οργανισμό. Ως μέθοδος λουσιφεράσης, χρησιμοποιείται μια ουσία που ονομάζεται κολελεντραζίνη.
Μπορείτε να εργαστείτε με το εργαστήριο μας EUROLAB για δοκιμές κυτταροτοξικότητας.