Pruebas de citotoxicidad

Laboratorio de Ensayos de Citotoxicidad.

La citotoxicidad se refiere a la tasa de efectos tóxicos en una célula viva. Se realizan una serie de pruebas para comprender esta relación. De hecho, las pruebas que se evalúan midiendo la tasa de proliferación y los efectos tóxicos en la célula se llaman pruebas de citotoxicidad.

Estas pruebas se recogen bajo el tema principal 3.

  • Pruebas con sales de tetrazolio.
  • Prueba de liberación de enzimas LDH
  • Forman pruebas de citotoxicidad incluyendo métodos de luminiscencia.

Pruebas realizadas con la ayuda de sales de tetrazolio: Las sales de tetrazolio son compuestos que son compuestos orgánicos heterocíclicos. Se ha sintetizado e identificado con más de miembros de 1000 a partir de los años en que se descubrió (Altman, 1976). Junto con la reducción de las sales de tetrazolio al tomar electrones, también ayuda a transformar el formazán en una estructura llamada cambio de color. Las reacciones de color solo se encuentran en las células vivas. Las pruebas de tetrazolio se experimentan en tres etapas. En la primera etapa, las células vivas están expuestas a una cierta cantidad de sustancia tóxica. En el segundo paso, la sustancia tóxica se elimina una de la otra y el compuesto de tetrazolio se agrega y se incuba durante 1-4 horas. En las últimas etapas, el cambio de color se mide por el método espectrofotométrico y se produce la determinación del número de células vivas o muertas.

 Prueba de liberación de enzimas LDH: otro método utilizado en el análisis de la viabilidad celular es la determinación de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada de las células dañadas o muertas al medio. (Decker y Lohmann-Matthes, 1988; Korzeniewski y Callewaert, 1983). La lactato deshidrogenasa se conoce como una enzima citoplásmica que se encuentra en todas las células. Cuando las células están expuestas a efectos tóxicos, su integridad de la membrana plasmática se altera y la enzima LDH se filtra de las células y pasa al medio. Por lo tanto, la evaluación del daño se lleva a cabo midiendo la actividad de la enzima LDH después de la exposición.

Métodos de luminiscencia:

Prueba de fluorescencia del azul de Alamar y otros métodos de fluorescencia: la prueba de azul de Alamar fue utilizada por primera vez por personas de Erb y Ehlers (1950) para la determinación de contaminación bacteriana en líquidos biológicos y leche, y más tarde en el estudio de Ahmed et al. (1950) adaptó estas pruebas como una opción lateral a la prueba de incorporación de timidina [1994 H] radioactiva. Este método se basa en la conversión del compuesto llamado azul alamar (resazurina) en el compuesto de resorufina junto con las células vivas. La resazurina se conoce como un colorante azul oxidativo redox, que pasa libremente a través de la membrana celular para ingresar a la célula, donde se reduce y se transforma en un compuesto de resorufina rosa fluorescente. Las células muertas no pueden reducir la resazurina y no son capaces de generar una señal de fluorescencia debido a la pérdida de la actividad metabólica. La señal resultante se detecta mediante el uso de fluorómetros y la intensidad aumenta a medida que aumenta el número de células viables.

Prueba de bioluminiscencia de ATP: los abusadores de adenosina trifosfato (ATP) actúan como fuentes de energía con sistemas biológicos y se pueden encontrar en todas las células metabólicamente activas. (Crouch et al., 1993). Después de la muerte celular, el estado de síntesis de ATP de la célula desaparece y las ATPasas endógenas realizan una rápida degradación de la ATP fácilmente. Por esta razón, el contenido de ATP intracelular se ha descrito como el principal indicador de la viabilidad celular y se está convirtiendo en uno de los métodos de determinación de la viabilidad. La prueba de bioluminiscencia de ATP se ha definido como el método más rápido, más sensible y más fácil entre las pruebas de viabilidad realizadas en múltiples (Lomakina et al., 2015; Riss et al., 2006).

Prueba de bioluminiscencia en tiempo real: la mayoría de las pruebas de viabilidad tienen la forma de un formato de punto final cuyas células no se han destruido o no se pueden seguir investigando, lo que hace imposible la cinética y el análisis en tiempo real de sustancias tóxicas. Debido a que la toxicidad es dependiente del tiempo y de la dosis, los efectos de diferentes rangos de dosis solo se pueden entender mediante el estudio en diferentes momentos. Similar al ensayo de bioluminiscencia de ATP, la enzima luciferasa también se usó en este ensayo. Sin embargo, la enzima luciferasa usada en este ensayo se obtuvo de un organismo diferente. Como el proceso de luciferasa, se utiliza una sustancia llamada coelenterazina.

Puede trabajar con nuestro laboratorio EUROLAB para pruebas de citotoxicidad.