Sytotoksisuus viittaa toksisten vaikutusten määrään elävässä solussa. Tämän suhteen ymmärtämiseksi suoritetaan useita testejä. Itse asiassa testejä, jotka arvioidaan mittaamalla solun proliferaatiotaajuus ja toksiset vaikutukset, kutsutaan sytotoksisuustesteiksi.
Nämä testit kerätään pääaiheessa 3.
- Testit tetratsoliumsuoloilla
- LDH-entsyymin vapauttamistesti
- Ne muodostavat sytotoksisuuskokeet, mukaan lukien luminesenssimenetelmät.
Tetratsoliumsuolojen avulla tehdyt testit: Tetrasolium- suolat ovat yhdisteitä, jotka ovat heterosyklisiä orgaanisia yhdisteitä. Se on syntetisoitu ja tunnistettu enemmän kuin 1000-jäseniä vuosien varrella, jolloin se havaittiin (Altman, 1976). Yhdessä tetrasolium-suolojen vähenemisen kanssa elektronien avulla se myös auttaa transformoimaan formazaanin rakenteeksi, jota kutsutaan värinmuutokseksi. Värireaktiot löytyvät vain elävistä soluista. Tetrasoliumkokeita koetaan kolmessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa elävät solut altistetaan tietylle määrälle myrkyllistä ainetta. Toisessa vaiheessa toksinen aine poistetaan toisistaan ja lisätään tetrasoliumyhdistettä ja inkuboidaan 1-4-tuntia. Viimeisissä vaiheissa värimuutos mitataan spektrofotometrisellä menetelmällä ja elävien tai kuolleiden solujen lukumäärän määrittäminen.
LDH-entsyymin vapauttamistesti: Toinen solujen elinkelpoisuuden analyysissä käytetty menetelmä on vahingoittuneista tai kuolleista soluista vapautuneen laktaattidehydrogenaasin (LDH) aktiivisuuden määrittäminen väliaineeseen. (Decker ja Lohmann-Matthes, 1988; Korzeniewski ja Callewaert, 1983). Laktaattidehydrogenaasi tunnetaan sytoplasmisena entsyyminä, joka löytyy kaikissa soluissa. Kun solut altistetaan myrkyllisille vaikutuksille, niiden plasmamembraanin eheys hajotetaan ja LDH-entsyymi vuotaa soluista ja kulkee väliaineeseen. Täten vahingon arviointi suoritetaan mittaamalla LDH-entsyymiaktiivisuus altistuksen jälkeen.
Luminesenssimenetelmät:
Alamarin sininen fluoresenssitesti ja muut fluoresenssimenetelmät: Erb ja Ehlers (1950) käyttivät Alamar-sinistä testiä ensin biologisten nesteiden ja maidon bakteerien kontaminaation määrittämiseksi, ja myöhemmin Ahmed et al. (1950) sopeutti nämä testit rinnakkaisena vaihtoehtona radioaktiiviselle [1994 H] -tymidiinin inkorporaatiotestille. Tämä menetelmä perustuu yhdisteen, jota kutsutaan alamarsiniksi (resatsuriini), muuntamiseksi resorufiiniyhdisteeksi yhdessä elävien solujen kanssa. Resatsuriinia kutsutaan oksidatiiviseksi sinisen väriaineen redoksiksi, joka kulkee vapaasti solukalvon läpi soluun pääsemiseksi, jossa se pelkistetään ja muunnetaan fluoresoivaksi vaaleanpunaiseksi resorufiiniyhdisteeksi. Kuolleet solut eivät voi vähentää resatsuriinia eivätkä kykene tuottamaan fluoresenssisignaalia metabolisen aktiivisuuden menetyksen vuoksi. Tuloksena oleva signaali havaitaan käyttämällä fluorometrejä ja intensiteetti kasvaa, kun elinkelpoisten solujen lukumäärä kasvaa.
ATP-bioluminesenssitesti: Adenosiinitrifosfaatti (ATP) -molekyylit toimivat energialähteinä biologisilla järjestelmillä ja ne löytyvät kaikilta metabolisesti aktiivisilta soluilta. (Crouch et ai., 1993). Solukuoleman jälkeen solun ATP-synteesitila häviää ja endogeeniset ATPaasit hajottavat helposti ATP: n nopeasti. Tästä syystä solunsisäistä ATP-sisältöä on kuvattu solun elinkelpoisuuden pääindikaattorina ja siitä on tulossa yksi elinkelpoisuuden määritysmenetelmistä. ATP-bioluminesenssitesti on määritelty nopeimmaksi, herkimmäksi ja helpoimmaksi menetelmäksi monikerroksissa toteutettujen elinkelpoisuustestien joukossa (Lomakina et ai., 2015; Riss et ai., 2006).
Reaaliaikainen bioluminesenssitesti: Suurin osa elinkelpoisuustesteistä on päätepisteen muodossa, jonka soluja ei ole tuhottu tai sallittu tutkia edelleen, jolloin myrkyllisten aineiden kinetiikka ja reaaliaikainen analysointi on mahdotonta. Koska toksisuus on aika- ja annosriippuvainen, eri annosalueiden vaikutukset voidaan ymmärtää vain tutkimalla eri aikoina. Samoin kuin ATP-bioluminesenssianalyysissä, tässä määrityksessä käytettiin myös lusiferaasientsyymiä, mutta tässä määrityksessä käytetty lusiferaasientsyymi saatiin eri organismista. Lusiferaasimenetelmänä käytetään ainetta, jota kutsutaan koelenteratsiiniksi.
Voit työskennellä laboratoriomme EUROLABin kanssa sytotoksisuustesteihin.