Citotoxicitási vizsgálatok

Citotoxicitási vizsgálati laboratórium

A citotoxicitás az élő sejtekben a toxikus hatás mértékére utal. Ennek az aránynak a megértéséhez számos tesztet végeznek. Tény, hogy a sejtek proliferációs sebességének és toxikus hatásainak mérésével végzett vizsgálatokat citotoxicitási teszteknek nevezzük.

Ezeket a teszteket az 3 fő témakörben gyűjtöttük össze.

  • Vizsgálatok tetrazolium sókkal
  • LDH enzimkibocsátási teszt
  • Ezek citotoxicitási teszteket alkotnak, beleértve a lumineszcencia módszereket is.

A tetrazolium-sók segítségével végzett vizsgálatok: A tetrazolium-sók olyan vegyületek, amelyek heterociklusos szerves vegyületek. Szintetizálták és több mint 1000 taggal azonosították azokat a felfedezett évektől (Altman, 1976). A tetrazolium sók elektronokkal történő redukciójával párhuzamosan a formazán átalakul a színváltozásnak nevezett struktúrává. A színreakciók csak az élő sejtekben találhatók. A tetrazolium-teszteket három szakaszban végezzük. Az első lépésben az élő sejteket bizonyos mennyiségű toxikus anyagnak tesszük ki. A második lépésben a toxikus anyagot egymástól eltávolítjuk, és tetrazolium-vegyületet adunk hozzá és inkubáljuk 1-4 órákban. Az utolsó szakaszokban a színváltozást spektrofotometriás módszerrel mérjük, és az élő vagy elhalt sejtek számát határozzuk meg.

 LDH enzimkibocsátási teszt: A sejtek életképességének elemzésében egy másik módszer a laktát-dehidrogenáz (LDH) aktivitásának meghatározása a sérült vagy elhalt sejtekből a közegbe. (Decker és Lohmann-Matthes, 1988; Korzeniewski és Callewaert, 1983). A laktát-dehidrogenáz az összes sejtben található citoplazmatikus enzimként ismert. Amikor a sejtek toxikus hatásnak vannak kitéve, a plazmamembrán integritása megszakad, és az LDH enzim szivárog a sejtekből, és áthalad a közegbe. Így a kárbecslés az expozíció utáni LDH enzimaktivitás mérésével történik.

Lumineszcencia módszerek:

Alamar kék fluoreszcencia teszt és egyéb fluoreszcencia módszerek: Az Alamar kék tesztet először Erb és Ehlers (1950) használta a biológiai folyadékok és a tej bakteriális szennyeződésének meghatározására, majd később Ahmed et al. (1950) alkalmazta ezeket a teszteket a radioaktív [1994 H] timidin beépítési vizsgálatának oldalsó opciójaként. Ez az eljárás az alamar-kék (resazurin) vegyületnek az élő sejtekkel együtt resorufin-vegyületté történő átalakításán alapul. A rezazurint oxidatív kék színezék redox-ként ismerjük, amely szabadon halad át a sejtmembránon, hogy belépjen a sejtbe, ahol redukálódik és fluoreszkáló rózsaszín rezorufin-vegyületké alakul át. A halott sejtek nem képesek csökkenteni a rezazurint, és nem képesek az anyagcsere-aktivitás elvesztése miatt fluoreszcencia jelet generálni. Az eredményül kapott jelet fluorométerek felhasználásával detektáljuk, és az intenzitásnövekedés hatására az intenzitás növekszik.

ATP biolumineszcencia teszt: Az adenozin-trifoszfát (ATP) moleszterek biológiai rendszerekkel energiaforrásként működnek, és minden metabolikusan aktív sejtben megtalálhatók. (Crouch és munkatársai, 1993). A sejthalál után a sejt ATP szintézis állapota eltűnik, és az endogén ATPázok gyorsan lebontják a könnyen ATP-t. Ezért az intracelluláris ATP-tartalmat a sejtek életképességének fő indikátoraként írták le, és az életképesség meghatározásának egyik módszere lesz. Az ATP biolumineszcencia tesztet a leggyorsabb, legérzékenyebb és legegyszerűbb módszerként definiáltuk a multiplikációkban végzett életképességi tesztek között (Lomakina et al., 2015; Riss et al., 2006).

Valós idejű biolumineszcencia teszt: Az életképességi tesztek többsége olyan végpont formátumú, amelynek sejtjeit nem pusztították el, vagy nem lehetett további vizsgálatokat végezni, így a toxikus anyagok kinetikáját és valós idejű elemzését lehetetlenné tették. Mivel a toxicitás idő és dózisfüggő, a különböző dózistartományok hatásait csak a különböző időkben végzett tanulással lehet megérteni. Az ATP biolumineszcencia vizsgálatához hasonlóan ebben a vizsgálatban a luciferáz enzimet is alkalmaztuk, azonban az ebben a vizsgálatban használt luciferáz enzimet egy másik szervezetből nyertük. A luciferáz-eljárás során egy coelenterazin nevű anyagot használnak.

A citotoxicitási vizsgálatokhoz az EUROLAB laboratóriumunkkal dolgozhat.