Cytotoxicita označuje rychlost toxických účinků v živé buňce. Pro pochopení tohoto poměru se provádí řada testů. Testy, které se hodnotí měřením rychlosti proliferace a toxických účinků v buňce, se nazývají testy cytotoxicity.
Tyto testy jsou shromažďovány pod hlavním tématem 3.
- Testy s tetrazoliovými solemi
- Test uvolňování enzymů LDH
- Tvoří testy cytotoxicity včetně luminiscenčních metod.
Testy prováděné pomocí tetrazoliových solí: tetrazoliové soli jsou sloučeniny, které jsou heterocyklickými organickými sloučeninami. To bylo syntetizované a identifikoval s více než 1000 členy od let to bylo objeveno (Altman, 1976). Spolu s redukcí tetrazolium solí tím, že vezme elektrony, to také pomáhá transformovat formazan do struktury volal změnu barvy. Barevné reakce se vyskytují pouze v živých buňkách. Testy tetrazolia se provádějí ve třech fázích. V první fázi jsou živé buňky vystaveny určitému množství toxické látky. Ve druhém kroku se oddělí toxická látka a přidá se tetrazoliová sloučenina a směs se inkubuje po dobu 1-4. V posledních fázích se změnou barvy měří spektrofotometrická metoda a stanoví se počet živých nebo mrtvých buněk.
Test uvolňování LDH enzymu: Další metodou použitou při analýze životaschopnosti buněk je stanovení aktivity laktátdehydrogenázy (LDH) uvolněné z poškozených nebo mrtvých buněk do média. (Decker a Lohmann-Matthes, 1988; Korzeniewski a Callewaert, 1983). Laktát dehydrogenáza je známa jako cytoplazmatický enzym, který se nachází ve všech buňkách. Když jsou buňky vystaveny toxickým účinkům, je narušena jejich integrita plazmatické membrány a LDH enzym uniká z buněk a přechází do média. Posouzení poškození se tedy provádí měřením aktivity enzymu LDH po expozici.
Luminiscenční metody:
Fluorescenční test Alamar Blue a další fluorescenční metody: Test Alamar blue byl poprvé použit Erb a Ehlers (1950) osobami pro stanovení bakteriální kontaminace v biologických tekutinách a mléku a později ve studii Ahmeda et al. (1950) přizpůsobil tyto testy jako vedlejší možnost testu inkorporace radioaktivního [1994 H] thymidinu. Tento způsob je založen na přeměně sloučeniny zvané alamarová modrá (resazurin) na resorufinovou sloučeninu společně s živými buňkami. Resazurin je známý jako oxidační modrá redox barviva, která volně prochází buněčnou membránou pro vstup do buňky, kde je redukována a transformována do fluorescenční růžové resorufinové sloučeniny. Mrtvé buňky nemohou snížit rezazurin a nejsou schopny generovat fluorescenční signál v důsledku ztráty metabolické aktivity. Výsledný signál je detekován použitím fluorometrů a intenzita se zvyšuje s rostoucím počtem životaschopných buněk.
ATP Bioluminiscence Test: Adenosintrifosfát (ATP) molestery působí jako zdroje energie s biologickými systémy a lze je nalézt ve všech metabolicky aktivních buňkách. (Crouch et al., 1993). Po buněčné smrti zmizí stav syntézy ATP buňky a endogenní ATPázy provádějí rychlou degradaci snadno ATP. Z tohoto důvodu byl intracelulární obsah ATP popsán jako hlavní indikátor životaschopnosti buněk a stává se jednou z metod stanovení životaschopnosti. ATP bioluminiscenční test byl definován jako nejrychlejší, nejcitlivější a nejjednodušší metoda mezi testy životaschopnosti prováděnými v násobcích (Lomakina et al., 2015; Riss et al., 2006).
Test bioluminiscence v reálném čase: Většina testů životaschopnosti je ve formě koncového formátu, jehož buňky nebyly zničeny nebo umožněny další zkoumání, což znemožnilo kinetiku a analýzu toxických látek v reálném čase. Protože toxicita je závislá na čase a dávce, účinky různých rozsahů dávek mohou být pochopeny pouze studiem v různých časech. V tomto testu byl také použit luciferázový enzym podobný testu ATP bioluminiscence, avšak luciferázový enzym použitý v tomto testu byl získán z jiného organismu. Jako proces luciferázy se používá látka zvaná coelenterazin.
Pro testování cytotoxicity můžete pracovat s naší laboratoří EUROLAB.